技术支持/常见问题

微生物多样性

Microbial diversity

问题1:什么是Reads、Index,Barcode、Tag、OTU?

答:Reads:高通量测序平台产生的序列标签称为reads;Barcode:与Index同义,指在测序过程中接头序列所包含的的用来区分不同样本的一小段基 因序列;Tag:是一段比较短的序列,在PE测序的一对reads,通过两者之间的overlap拼接起来的一条序列 ,用于标注其它序列的;OTU(Operational Taxonomic Units):是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,种,属,分组等),可以认为是为 一个菌种设置的同一 个标志。

问题1:测序提供的数据量是多少?

答:由于不同环境样品的物种成分、丰度都各不相同,所需的测序量也不一样。我们会根据合作伙伴提供样品的具体情况及研究目的,选择合适的测序 深度,保证单个样本测序条数高于2万tags,同时 可以按照客户需求增加测序条数。

问题1:项目所需周期多长?

答:我们接到客户提供的样品后,第一时间进行试验,在样品检测合格的前提下,项目周期正常情况下在35个自然日内完成。

问题1:样本要求及标准是什么?

答:DNA浓度≥20ng/uL,体积≥15uL,OD260/280=1.8~2.0并确保DNA无降解。土壤,粪便,淤泥样本量≥1g,水体样本2-5L过滤后的滤膜;所有 组织提取均采用进口专用试剂盒。样本检测采用Nanodrop检测系统、琼脂糖凝胶电泳、 Qubit、 Caliper、Aglient 2100等检测方法。

转录调控

Transcriptional regulation

问题1:在测序过程中,不同样本的数据结果是否有差异?若不同样本的数据存在差异,是否会影响比对分析的结果?

答:

测序过程中,不同样本产出的数据存在差异,是正常现象。这是因为样本间数据量的差异可能会使各个样本的mapped reads 有差异,但不一定影 响如基因定量等后续分析结果;对于转录组分析而言,对基因的定量结果是较为重要的,可通过基因定量结果从饱和曲线中获得。每个样本在各自数据 量条件下,对基因的定量结果均达到饱和时,足够对其进行准确定量分析。


问题1:如何判断一个基因是否是差异基因?如果是差异基因,如何判断该基因的表达量是上调还是下调?

答:

判断一个基因是否有差异基因无生物学重复时,先采用TMM对readcount数据进行标准化处理,然后用DEG-seq进行差异分析,筛选阈值为q-value <0. 005&|log2FoldChange|>1; 对于差异基因,如果基因的log2 Foldchange>0,则认为该差异基因是上调,反之,若log2Foldchange <0,认为该差异基 因是下调。

问题1:如何评价RNA是否合格并满足后续的建库试验?

答:

由于RNA易降解,所以在准备样本以及运输(用干冰运输)和提取等过程中全部在冰上操作,因此在文库构建之前,我们会对RNA样品进行严格检 测,检测内容包括:

• 通过琼脂糖凝胶电泳判断RNA降解及污染情况,判定标准为有2条清晰条带,且28S/16S为2:1关系;

• 由NanoDrop检测RNA纯度,判定标准为OD260/280比值≥1.0;

• 通过Agilent 2100对RNA的完整性进行精确检测,其标准为RIN值≥6.5,图谱基线无移,5S峰正常。


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