转录组/全长转录组测序

全长转录组测序

技术简介

基于Pacbio单分子实时测序技术(Single Molecule Real-Time SequencingSMRT),借助其超长读长优势,无需组装,直接获得从5’末端到3’PolyA尾的高质量的全长转录本信息。利用全长转录组测序,可获取全长mRNA序列,对基因异构体、可变剪切、融合基因进行准确鉴定。

技术路线

送样建议

样本类型

浓度   (Qubit)

总量

完整性及纯度

Total RNA

≥300 ng/μL

≥10 μg

RIN≥8.028S/18S≥1.3;基线平整,5S峰正常;OD260/280≥1.8OD260/230≥1.8

 技术参数

 

测序策略

数据量

周期

三代全长转录组测序

PacBio RS II

15G data

95 个自然日

 案例分析

全长转录组测序揭秘玉米转录组的复杂性[1]

研究背景

玉米(Zea mays)是全球重要的农作物,也是研究植物转录组代谢通路的遗传模型。玉米基因组序列于2009年公布,后续利用ESTRNA-Seq转录组数据对其基因注释进行了补充。然而RNA-Seq中,短读长无法提供转录本全长序列,限制了可变剪接形式的鉴定等。

研究方

采集玉米自交系B73不同发育阶段的6个组织(根、花粉、胚芽、胚乳、幼雌穗、幼雄穗),提取mRNA,构建6种插入片段文库(<1, 1–2, 2–3, 3–5, 4–6 >5 kb),进行全长转录组测序和二代RNA-Seq测序(每个样品三个重复)。

图1. 新鉴定LncRNA分析

研究结果

测序得到的全长转录本序列,其中有94.2%能够比对到玉米RefGen_v3参考基因组上。经聚类分析得到了来自53个家族(RefGen_v3总共57个)的新的isoform,对应26,943个基因,转录因子5,423个,其中155个与生长激素应答功能相关。而鉴定的878个候选LncRNA中,867个(平均读长为1.1kb)为新发现的LncRNA,具有结构和组织特异性。进一步对isoformlncRNAnon-lncRNA区域进行甲基化分析,发现non-lncRNA genes具有相对较高的CG甲基化水平,而lncRNAs具有相对较高的CHG甲基化水平,这些甲基化水平可能与玉米不同组织中基因的不同表达水平有关。

研究结论

PacBio超长读长无需组装即可得到全长转录组信息,相比于Illumina短读长组装的isoform而言,更能直接准确地获得isoform信息,有助于解密玉米转录组复杂的基因表达信息。

 

参考文献

[1]. Wang B, Tseng E, Regulski M, et al. Unveiling the complexity of the maize transcriptome by single-molecule long-read sequencing[J]. Nature Communications, 2016, 7:11708.

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