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微生物多样性  


问题1:什么是Reads、Index,Barcode、Tag、OTU?

答:Reads:高通量测序平台产生的序列标签称为reads;
Barcode:与Index同义,指在测序过程中接头序列所包含的的用来区分不同样本的一小段基因序列;
Tag:是一段比较短的序列,在PE测序的一对reads,通过两者之间的overlap拼接起来的一条序列 ,用于标注其它序列的;
OTU(Operational Taxonomic Units):是在系统发生学研究或群体遗传学研究中,为了便于进行分析,人为给某一个分类单元(品系,种,属,分组等),可以认为是为一个菌种设置的同一 个标志。


问题2:测序提供的数据量是多少?

答:由于不同环境样品的物种成分、丰度都各不相同,所需的测序量也不一样。我们会根据合作伙伴提供样品的具体情况及研究目的,选择合适的测序深度,保证单个样本测序条数高于2万tags,同时 可以按照客户需求增加测序条数。


问题3:项目所需周期多长?

答:我们接到客户提供的样品后,第一时间进行试验,在样品检测合格的前提下,项目周期正常情况下在35个自然日内完成。


问题4:样本要求及标准是什么?

答:DNA浓度≥20ng/uL,体积≥15uL,OD260/280=1.8~2.0并确保DNA无降解。土壤,粪便,淤泥样本量≥1g,水体样本2-5L过滤后的滤膜;
所有组织提取均采用进口专用试剂盒。样本检测采用Nanodrop检测系统、琼脂糖凝胶电泳、 Qubit、 Caliper、Aglient 2100等检测方法。


转录调控


问题1:在测序过程中,不同样本的数据结果是否有差异?若不同样本的数据存在差异,是否会影响比对分析的结果?

答:测序过程中,不同样本产出的数据存在差异,是正常现象。这是因为样本间数据量的差异可能会使各个样本的mapped reads 有差异,但不一定影响如基因定量等后续分析结果;对于转录组分析而言,对基因的定量结果是较为重要的,可通过基因定量结果从饱和曲线中获得。每个样本在各自数据量条件下,对基因的定量结果均达到饱和时,足够对其进行准确定量分析。

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问题2:如何判断一个基因是否是差异基因?如果是差异基因,如何判断该基因的表达量是上调还是下调?

答:判断一个基因是否有差异基因无生物学重复时,先采用TMM对readcount数据进行标准化处理,然后用DEG-seq进行差异分析,筛选阈值为q-value<0.005&|log2FoldChange|>1; 对于差异基因,如果基因的log2 Foldchange>0,则认为该差异基因是上调,反之,若log2Foldchange<0,认为该差异基因是下调。


问题3:如何评价RNA是否合格并满足后续的建库试验?

答:由于RNA易降解,所以在准备样本以及运输(用干冰运输)和提取等过程中全部在冰上操作,因此在文库构建之前,我们会对RNA样品进行严格检测,检测内容包括:
• 通过琼脂糖凝胶电泳判断RNA降解及污染情况,判定标准为有2条清晰条带,且28S/16S为2:1关系;
• 由NanoDrop检测RNA纯度,判定标准为OD260/280比值≥1.0;

• 通过Agilent 2100对RNA的完整性进行精确检测,其标准为RIN值≥6.5,图谱基线无移,5S峰正常。

 


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